桑格定序

雙去氧鏈終止法（英語：dideoxyribonucleotide ［簡稱 dideoxy］ chain-termination method），又稱桑格法（英語：Sanger method），為一種常用的核酸定序技術，用於DNA分析，由英國生物化學家弗雷德里克·桑格於1977年發明。雙去氧鏈終止法與化學降解法以及其衍生方法統稱為第一代DNA定序技術，為人類基因組計劃所使用主要定序方法。

原理

雙去氧鏈終止法採用DNA複製原理。 Sanger定序反應體系中包括目標DNA片段、去氧三磷酸核苷酸（dNTP）、雙去氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、定序引子及DNA聚合酶等。定序反應的核心就是其使用的ddNTP：由於缺少3'-OH基團，不具有與另一個dNTP連接形成磷酸二酯鍵的能力，這些ddNTP可用來中止DNA鏈的延伸。此外，這些ddNTP上連接有放射性同位素或螢光標記基團，因此可以被自動化的儀器或凝膠成像系統所檢測到。

定序反應過程

早期基於Sanger法的定序設置了四個平行的定序反應，每一個反應中分別包括目標片段、DNA聚合酶、定序引子、四種dNTP和一種特定類型螢光（或放射性同位素）標記的ddNTP（即不同的反應中分別為ddATP、ddGTP、ddCTP及ddTTP）。通過這樣的配置，在不同的反應中DNA鏈將會分別在A、G、C及T位中止，並形成不同長度的DNA片段。這些片段隨後可被凝膠電泳分開並顯示出來。變性丙烯醯胺電泳有四個泳道，每個泳道對應一種鹼基。電泳結束後通過放射自顯影或紫外顯影可讀出X光片或凝膠影像。圖像中的每一個暗帶表示一個雙去氧核苷酸（ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP）摻入後鏈終止的DNA片段的結果。四個泳道之間的不同暗帶的相對位置可以用來讀取（從底部到頂部）DNA序列，從而得到該目標片斷的鹼基排列順序。如圖A所示，該DNA片段的序列順序為ATGCTTCGGAT。

隨著Sanger定序技術的發展，ddNTP的標記技術有了很大的提高。不同種類的ddNTP可以被不同螢光基團所標記，而這些螢光基團具有相同的激發波長和不同的發射波長，因而在光學上表現為不同的顏色。因此，定序反應可以在一個體系中進行，滿足了業界對定序速度、自動化及通量不斷提高的要求。如圖B所示，原本四個不同的定序反應被單一定序反應所取代。

自動化定序儀

桑格法操作簡便，因此被廣泛使用，在其基礎上衍生出螢光自動定序技術等。基於螢光標記和雙去氧鏈終止法的螢光自動定序儀被廣泛使用，用於人類基因組計劃等項目。基於毛細管電泳技術，Sanger定序現在已經可以在高度自動化的定序儀中進行，商用的產品包括Life Technologies的3130xL、3730xL、3500Dx與3500Dx xL定序儀及Beckman的GeXP遺傳分析系統等。這類系統最長可測定600-1000bp的DNA片段，且對重復序列和多聚序列的處理較好，序列準確性高。但是，這類定序儀在24h內可測定的DNA分子數一般不超過10,000個，通量較低，每鹼基定序成本較高，不適合大規模平行定序。其中ABI的3500Dx系列最近獲得美國FDA、歐盟與中國SFDA批准，成為第一台進入臨床使用的基因定序儀。

參考文獻

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參見