聚合酶連鎖反應
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聚合酶連鎖反應（英語：Polymerase chain reaction，縮寫：PCR）又稱多聚酶鏈式反應，是一項利用DNA雙鏈複製的原理，在生物體外複製特定DNA片段的核酸合成技術。透過這項技術，可在短時間內大量擴增目的基因（標的基因）[1][2]，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。DNA 體外擴增的實現首先基於DNA半保留複製原理，還有鹼基互補配對原則，即複製的過程中雙鏈DNA會解鏈，由雙鏈變成單鏈，溫度一般為95℃；之後溫度降下來，引子會結合到DNA單鏈上，在DNA聚合酶的作用下，把游離的dNTP按照鹼基互補配對原則結合到單鏈上，形成一條由舊鏈和新鏈雜合成的新的雙鏈DNA。這個過程可概括為變性、黏合、延伸三個基本步驟。
PCR是一種簡單，廉價和可靠的複製DNA片段的方法， 可能也是分子生物學中使用最廣泛的技術。這個概念適用於現代生物學和相關科學的許多領域[3]，如生物醫學研究，犯罪取證和分子考古學[4]等。
微生物複製是一個費時耗力的流程。首先要將DNA經限制酶剪裁，再利用連接酶（Ligase）加到運載體（Vector）中，之後利用受控電脈衝瞬間電擊，在質膜上形成可逆性微孔的「電穿孔」（electroporation）或是利用生理極限高溫刺激的「熱休克」（heat shock）的方式，送到大腸桿菌感受態細胞（competent cell）中，將此菌於培養皿大量繁殖培養，再經過繁複的分離、純化過程，時間通常需要近一週，才能大量複製片段[5]。所以僅需一小時的PCR能節省大量時間和繁複的操作，聚合酶連鎖反應技術被廣泛地運用在醫學和生物學的實驗室，例如用於判斷檢體中是否會表現某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷、基因複製，以及親子鑑定。
歷史
[編輯]-
最早的PCR機器Baby Blue 1986Thermocycler -
能協同操作的兩組式機器 -
8塊加熱板的循環機型
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凱利·穆利斯（Kary Mullis）[6][7]，時為Cetus公司的僱員，於1983年開發了此技術。這項技術使他成為1993年諾貝爾化學獎的獲得者。穆利斯的想法是，利用一種人工方法，和反覆相同程式的方法，並利用一種特殊的酶——即DNA聚合酶來擴增特定的DNA片段。
DNA聚合酶天然存在於生物體內，在細胞分裂前進行DNA的複製。當DNA開始複製時，解旋酶將雙股的DNA分開成兩個單股。DNA聚合酶便結合在兩DNA單股鏈上，生成互補鏈。在穆利斯最初的聚合酶連鎖反應中，將DNA聚合酶用於體外試驗。但是，沒有採用正常細胞常溫解旋的方法，而是把雙鏈DNA加熱到96℃，使得雙鏈分離成為兩條單鏈。但是在這個溫度下，DNA聚合酶被破壞，因此在每個循環的加熱步驟後必須補充新的聚合酶。穆利斯的原始聚合酶連鎖反應效率極低，需要大量時間和DNA聚合酶，並且在整個聚合酶連鎖反應中都需要人來照看。
後來，由嗜熱細菌水生棲熱菌（Thermus aquaticus）體內產生的DNA聚合酶改善了這種低效的聚合酶連鎖反應。由於嗜熱細菌生活在溫度達到50至80 °C（122至176 °F）的間歇泉中，它的DNA聚合酶具有耐熱性。在用於聚合酶連鎖反應時，高溫並不能破壞這種DNA聚合酶，因此不需要不斷加入新的聚合酶，聚合酶連鎖反應由此變得簡單並且可以由機器操作。
最初的具有耐熱性的DNA聚合酶來自於水生棲熱菌（Thermus aquaticus），是1976年台灣科學家錢嘉韻（Alice Chien）從黃石國家公園發現的，因此被稱為Taq。Taq酶被廣泛用於當前的聚合酶連鎖反應操作中，Taq酶的缺點是它缺少3'->5'校正外切酶活性，因此在複製DNA時有時會出錯，造成DNA序列突變（錯誤）。但是又是從古菌中獲得的Pwo酶及Pfu酶，發現均有校正機制，能夠大大降低聚合酶連鎖反應中的突變。將Taq與Pfu結合使用可以保證真實準確的能夠擴增DNA。不但如此，現在一些廠商利用蛋白質的模擬分析，將DNA聚合酶的結構進行人工修改，還可以合成出性能遠超原本自然提取而來的酶。
專利之爭
[編輯]聚合酶連鎖反應技術的專利由Cetus公司持有，穆利斯發明聚合酶連鎖反應技術的時候在那個公司工作。Taq聚合酶也受專利保護。關於這個技術有幾個訴訟案，包括著名的杜邦訴訟案。製藥公司Hoffmann-La Roche於1992年買下了專利並持有至今。
在世界各地的多個司法管轄區，羅氏與Promega公司與Taq聚合酶相關的專利爭鬥仍然在繼續。法律上的爭論已經超出了聚合酶連鎖反應和Taq聚合酶專利的期限，這些專利已於2005年3月28日到期。
操作過程
[編輯]聚合酶連鎖反應用於擴增一小段已知的DNA片段，可能是單個基因，或者僅僅是某個基因的一部分。與活體生物不同的是，PCR只能複製很短的DNA片段，通常不超過10kbp。DNA是雙鏈分子，因此用互補DNA雙鏈的構造單位（核苷酸）來度量其大小，單位為鹼基對（base pair, bp）。某些特定的方法可以擴增40kbp左右的片段，但是這種大小與真核細胞的染色體DNA相比仍然是很少的。例如，人的體細胞DNA含有大約30億個鹼基對。目前應用的聚合酶連鎖反應需要幾個基本組成：
- DNA模板（template），含有需要擴增的DNA片段。
- 2種引子（primer），決定了需要擴增的起始和終止位置。（見下面引子一節）
- DNA聚合酶（polymerase），複製需要擴增的區域。
- 脫氧核苷三磷酸（dNTP），用於構造新的互補鏈。
- 含有鎂離子的緩衝體系，提供適合聚合酶行使功能的化學環境。
聚合酶連鎖反應在熱循環設備中進行。PCR儀可以將反應管加熱或冷卻到每步反應所需的精確的溫度。為防止反應體系中液體產生蒸氣，通常在反應管上加蓋加熱的蓋子（比加熱板溫度來的高），或者在反應體系表面加入一層石蠟油。
引子
[編輯]特定的專一性引子決定了所擴增的DNA片段。而引子（primer）本質上是人工合成的短DNA片段，一般不超過50個鹼基（通常18－25個），它們與所要擴增的DNA片段的起始和終止區域完全互補。在「黏合」時引子結合於DNA模板的起始和終止點，DNA聚合酶結合到這兩個位置，開始合成新的DNA鏈。
選擇引子的長度和熔點（Tm）要考慮許多條件。引子的熔點與聚合酶連鎖反應第一步中DNA的熔點不同，是指50％的引子與模板結合的溫度，高於這個溫度的引子與模板就不能有效結合。這個溫度隨着引子長度的增加而升高。如果引子長度太短，就有可能與DNA模板的幾個位置結合，造成非特異性複製。另一方面，引子長度也受限於Tm。如果Tm太高，即高於80℃，也會導致問題，因為DNA聚合酶在此溫度下活性較低。引子最優長度通常為20到40個鹼基，熔點從60℃到75℃。
有時也用到簡併引子，是一些相似但不相同的引子的混合物。通常用於從不同的生物DNA中擴增相同的基因，因為這些基因通常都是近似但不相同的。應用兼併引子的另一種情況是根據蛋白質序列設計引子時，由於幾個不同的密碼子都能編碼一個氨基酸，通常難以判斷在DNA中究竟是哪個密碼子編碼的這個氨基酸。例如編碼異白氨酸的引子可能使用"ATH"，A是腺嘌呤，T是胸腺嘧啶，H可能是腺嘌呤，胸腺嘧啶或者胞嘧啶（關於鹼基如何編碼蛋白質，可查看遺傳密碼）。使用簡併引子在很大程度上降低了聚合酶連鎖反應擴增等特異性，這個問題可以使用遞減PCR（touchdown PCR）部分地解決。
基於上述考慮，設計引子可以採取以下原則：
- GC所佔比例為40％－60％
- 計算兩個引子的Tm（Tm值=4(G+C) +2(A+T)），使之不相差5℃，並且擴增產物的Tm與引子的相差不超過10℃。
- 黏合溫度通常比計算的最低Tm低5℃，但是要根據經驗為不同條件下的聚合酶連鎖反應選擇不同的黏合溫度。
- 內部的具有自身互補性的髮夾結構不超過4個，其二聚體中不超過8個。
- 3'末端尤其重要，必須不含有與其他引子互補的序列，並且要與模板完全互補。
現有一些幫助設計引子的程式（見外部連結）。
步驟
[編輯]一般的聚合酶連鎖反應由20到35個循環組成，每個循環包括以下3個步驟：
- 變性：利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引子完全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來機器就控制溫度進入循環階段。
- 黏合，又稱復性、退火、降溫貼合、緩冷配對、引子黏合：在DNA雙鏈分離後，降低溫度使得引子可以結合於單鏈DNA上。此階段的溫度通常低於引子熔點5℃。錯誤的黏合溫度可能導致引子不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。新技術的融合型核酸聚合酶在此階段的溫度會高於熔點3~5℃，僅需時間5~10秒。
- 延長：DNA聚合酶由降溫時結合上的引子開始沿着DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴於DNA聚合酶。該步驟時間依賴於聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統的Taq估計合成1000bp大概需要1分鐘、較新的Tbr（來自於嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。有修正功能的則會比較慢。
實例
[編輯]優化聚合酶連鎖反應
[編輯]在實踐中，聚合酶連鎖反應可以因各種原因而失敗，原因可能是由於其對於污染的敏感性，導致擴增出錯誤的DNA產物。因此，人們已經開發了一些技術和步驟來優化聚合酶連鎖反應的反應條件，通過將聚合酶連鎖反應前的混合物與潛在DNA污染物分開的實驗室方案和流程解決了外源DNA的污染問題。這通常包括從用於分析的區域分離出聚合酶連鎖反應的設定區域（聚合酶連鎖反應產物的純化）、一次性塑料製品的使用以及對反應裝置之間的工作枱面徹底清潔。引子的設計技術在改善聚合酶連鎖反應產物產率和避免雜產物的形成是很重要的。替代緩衝成分和聚合酶的使用有助於較長或存在其他問題的DNA區域的擴增。在緩衝體系中加入試劑，如甲酰胺，或會增加聚合酶連鎖反應的特異性和產量。此外，可以利用計算機模擬理論聚合酶連鎖反應結果（電子聚合酶連鎖反應），以協助引子的設計。
最新進展
[編輯]PCR及其延伸技術
[編輯]- 遞減PCR（touchdown PCR）：前幾循環溫度逐漸下降。
- 逆轉錄PCR（RT-PCR）：以由mRNA逆轉錄而來的cDNA爲模板，也因為是從表現型基因來進行增量的，由此產生出來的cDNA產物不帶有內含子（基因中不具意義的段落），常應用於分子克隆技術。
- 熱啟動PCR（hot start PCR）：以高熱活化型核酸聚合酶進行反應，減少非專一性產物。
- 即時PCR（real-time PCR）：PCR過程中利用熒光探針或染料定量檢測，又稱定量PCR（quantitative PCR），可以進行多組對比。
- 巢式PCR（nested PCR）：先用低特異性引子擴增幾個循環以增加模板數量，再用高特異性引子擴增。
- 多重PCR（multiplex PCR）：在同一個管中使用多組引子。
- 復原條件PCR（reconditioning PCR）：PCR產物稀釋10倍後重新放入原濃度的引子和dNTP等循環3次，以消除產物中的異二聚體。
- dsRNA合成（dsRNA replicator）：合併使用high-fidelity DNA polymersae、T7 RNA聚合酶與Phi6 RNA replicase；從雙股DNA轉錄為對應的雙股RNA（dsRNA）。可應用於RNAi實驗操作。
- 低溫變性共擴增PCR（COLD-PCR, co-amplification at lower denaturation temperature-PCR）:用以檢測突變或特殊等位基因的PCR應用技術。
- 數字PCR（Digital-PCR, digital polymerase chain reaction）：將標準的PCR反應分割至每一個反應中僅1~2個copy。藉以偵測微小比例的基因差異。應用於：癌症突變基因、病原體檢測、藉由母血對胎兒做產前檢測。
一般 PCR 的原理是，靠着探針偵測設定的遺傳目標序列，接着經歷升溫、降溫的循環，將目標不斷複製放大，直到能夠判斷訊號。判斷陽性的標準，英文稱作「cycle threshold （CT） value」，即是 CT值。例如，若循環 35 次後能識別目標存在，CT值便是 35。
通常樣本內的病毒含量愈高，複製愈少次，便足以判斷陽性。舉例來說，原始量多只需 20 次，便能放大到超過足夠的量；原始量低需要到 35 次，才能放大到有存在感。（或是可以想像成自己的存款，要翻倍幾次才會超過 1 億元；存款愈多的話，需要翻倍愈少次。）[8]
應用
[編輯]鑑定基因
[編輯]人體內的細胞共有約為30億個鹼基對的DNA，每個人的DNA會有差異，具有差異的鹼基對數目達幾百萬之多，因此通過分子生物學方法顯示的DNA圖譜也因人而異，由此可以識別不同的人。所謂「DNA指紋」，就是把DNA作為像指紋那樣的獨特特徵來識別不同的人。由於DNA是遺傳物質，因此通過對DNA鑑定還可以判斷兩個人之間的親緣關係。
親子鑑定
[編輯]診斷遺傳病
[編輯]聚合酶連鎖反應允許白血病、淋巴瘤等惡性疾病的早早期診斷。此法是當今癌症研究中最發達的，並已被常規使用。聚合酶連鎖反應分析能以高於其他細胞10,000倍的敏感度在核酸DNA樣本中直接探測具特定轉錄的惡性細胞。
聚合酶連鎖反應同樣可以對不可培養的或生長緩慢的微生物（如分支桿菌、厭氧細菌、組培分析和動物模型中的病毒）進行定位。在微生物學中，聚合酶連鎖反應診斷性應用的基礎是傳染媒介的探測和從病原種系中藉助特定基因的分離出非致病的種系。
複製特定基因
[編輯]基因工程中目的基因常用PCR技術擴增，再導入載體內，以增加導入成功的概率。
誘變
[編輯]分析遠古DNA
[編輯]鑑定特定表型的突變體基因
[編輯]比較基因表達量
[編輯]基因圖譜建立
[編輯]DNA遺傳演化
[編輯]參考資料
[編輯]- ^ 存档副本. [2022-03-26]. （原始內容存檔於2022-05-02）.
- ^ 存档副本. [2022-03-26]. （原始內容存檔於2022-05-17）.
- ^ PCR. Genetic Science Learning Center, University of Utah. [2018-01-09]. （原始內容存檔於2020-03-02）.
- ^ Saiki, RK. Amplification of a Short DNA Stretch by Repeated Cycles of In Vitro DNA Polymerization (PDF). American Association for the Advancement of Science. [2018-01-09]. （原始內容存檔 (PDF)於2017-12-15）.
- ^ 技術文章——聚合脢連鎖反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）. [2016-11-25]. （原始內容存檔於2016-11-16）.
- ^ Bartlett, John M. S.; Stirling, David. A Short History of the Polymerase Chain Reaction. PCR Protocols 226. New Jersey: Humana Press. 2003-08-01: 3–6. ISBN 978-1-59259-384-2. doi:10.1385/1-59259-384-4:3 （英語）.
- ^ Mullis, Kary B. et al. "Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences" 美國專利第4,683,195號
- ^ CT值. PanSci 泛科學. [2021-10-20]. （原始內容存檔於2021-04-22） （中文（臺灣））.
外部連結
[編輯]- Primer-BLAST -NCBI提供的線上primer設計與比對軟件 （頁面存檔備份，存於互聯網檔案館）
- The reference in real-time PCR （頁面存檔備份，存於互聯網檔案館）
- eQMS::DNA （頁面存檔備份，存於互聯網檔案館） DNA Fingerprint Software
- 重疊延伸PCR克隆
